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Con el objetivo de mejorar las herramientas disponibles para la detección y tratamiento de enfermedades, entre 1973 y 1975 el argentino César Milstein junto con el alemán George Köhler –quien era su becario posdoctoral en ese momento–, lograron desarrollar un sistema para producir en el laboratorio anticuerpos puros capaces de detectar y unirse específicamente a regiones discretas –denominadas epitopes– dentro de un determinado antígeno. Por este descubrimiento, que transformó la historia de la medicina moderna, ganaron el Premio Nobel de Medicina en 1984. Ahora, Presidencia de la Nación de la Argentina declaró al 2021 como año homenaje al premio Nobel de Medicina doctor César Milstein, en reconocimiento a su “profundo compromiso con la ciencia”.
Si bien los anticuerpos monoclonales (AcM o mAbs, por sus siglas en inglés, que significan ‘monoclonal antibodies’) se utilizan desde hace más de 40 años para el desarrollo de medicamentos innovadores y para el tratamiento y diagnóstico de diversas enfermedades, ahora –por la emergencia de la COVID-19– toman un nuevo impulso debido a que científicos de todo el mundo estudian su uso como terapéuticos contra esa enfermedad.
Sin embargo, el descubrimiento de Milstein y Köhler también es una tecnología muy utilizada en el ámbito agropecuario. De hecho, son utilizados tanto para el diagnóstico de algunas enfermedades de interés veterinario, como la fiebre aftosa, la tuberculosis bovina y la rabia –las dos últimas son, además, zoonosis–, de interés agropecuario, como el Mal de Río Cuarto en maíz, y hasta para la investigación y el diseño de fármacos de nueva generación.
En términos generales, se sabe que el sistema inmune de los vertebrados superiores es capaz de responder ante la presencia de patógenos o sustancias extrañas al organismo mediante la producción de anticuerpos –proteínas que son capaces de unirse a ellos de forma tal de neutralizarlos o eliminarlos del individuo–. En este sentido, los anticuerpos monoclonales son una alternativa biotecnológica que deriva de este proceso natural.
“Los anticuerpos monoclonales son copias idénticas de un único tipo de anticuerpo producido por un linfocito B”, explicó Oscar Taboga, director del Instituto de Agrobiotecnología y Biología Molecular (IABIMO) del Centro de Investigación en Ciencias Veterinarias y Agronómicas (CICVyA) del INTA, quien agregó: “Los hibridomas, productores de anticuerpos monoclonales, son copias de células quiméricas creadas en el laboratorio a partir de un clon de un plasmocito productor de un anticuerpo específico, indistinguibles de los anticuerpos que nuestro cuerpo produce de forma natural”.
De todos modos, lo que Milstein hacía de manera artesanal, gracias al uso de la ingeniería genética, los científicos los crean en una fracción de tiempo. “Esas moléculas, producidas en el laboratorio, pueden actuar como anticuerpos ‘de diseño’ y permiten el desarrollo de diversos fármacos”, señaló Taboga quien resaltó que “aparte de ser una herramienta natural de defensa, son un instrumento súper potente para hacer test diagnósticos”.
Las aplicaciones pueden ser múltiples y no solo se limitan a detectar enfermedades en animales o en plantas, sino que también se pueden utilizar para identificar transgenes (genes foráneos) en cultivos –por ejemplo–. De hecho, en el Instituto de Biotecnología del INTA funciona el Laboratorio de detección de OGM (organismos genéticamente modificados), un servicio disponible para el sector privado de la producción agropecuaria y de la industria alimenticia a partir del análisis de granos, semillas, alimentos y materias primas. “Con un anticuerpo monoclonal, dirigido contra una enzima en particular, se puede determinar si una planta es transgénica o no”, ejemplificó Taboga quien señaló que se pueden utilizar para un sinnúmero de objetivos y aplicaciones.
El laboratorio posee acreditación del Organismo Argentino de Acreditación (OAA). Esto significa que cumple con los requisitos planteados por la normativa internacional IRAM 301 (ISO IEC 17025) en materia de calidad.
Desde una perspectiva terapéutica, el uso de los anticuerpos monoclonales es similar al de la terapia con plasma de convalecientes. Sin embargo, mientras el plasma de convaleciente es heterogéneo y contiene una composición muy variable de anticuerpos, en los que unos pueden ser efectivos y otros no, los tratamientos basados en anticuerpos monoclonales constituyen una forma mucho más moderna y depurada, “debido a que están hechos a partir de la selección de aquellos que, por ejemplo, tienen mayor capacidad de neutralizar a un determinado virus, son como una bala teledirigida”, afirmó Taboga.
En el ámbito veterinario, y gracias al uso de la ingeniería genética, un equipo de investigadores del Instituto de Agrobiotecnología y Biología Molecular (IABIMO) del Centro de Investigación en Ciencias Veterinarias y Agronómicas (CICVyA) del INTA, liderado por Fabiana Bigi, se enfocó en la producción de anticuerpos monoclonales para construir un test diagnóstico que detecte tuberculosis y paratuberculosis bovinas basado en la detección y cuantificación in vitro del interferón-gamma –IFN-γ– producido por linfocitos-T sensibilizados en respuesta al contacto con antígenos específicos.
En la Argentina, la tuberculosis bovina (TBB) es una enfermedad de alta prevalencia en rodeos ganaderos y en animales silvestres. Como afecta principalmente al ganado bovino, se trata de una enfermedad que puede provocar grandes pérdidas económicas, como resultado del bajo peso de los animales, mala calidad de la leche y el consecuente decomiso en frigoríficos y en mataderos. Además, debido a que el agente causal –la bacteria Mycobacterium bovis– se transmite a los seres humanos, constituye un importante problema de salud pública.
“En la actualidad, el diagnóstico de animales infectados se realiza mediante la prueba de la tuberculina o intradermorreacción que es el método oficial aprobado por los organismos internacionales”, expresó Bigi y agregó: “Nuestro objetivo es desarrollar una prueba alternativa que ayude a mejorar el diagnóstico”.
El test diagnóstico que está desarrollando Bigi con su equipo estará destinado al diagnóstico de ambas enfermedades basado en la detección y cuantificación in vitro del interferón gamma –IFN-γ–. “Entre otros aspectos positivos, este desarrollo contribuirá al control de la TBB y PTB con un producto de desarrollo nacional, innovador y de un costo accesible”, puntualizó la investigadora del INTA quien destacó que “este desarrollo local permitirá sustituir la importación de los test utilizados en la actualidad”.
Además de su utilidad como método diagnóstico, con esta herramienta Bigi y su equipo realizan investigaciones que buscan desentrañar cuáles son los mecanismos de replicación que utiliza la bacteria que provoca la tuberculosis para saber qué genes se pueden seleccionar para atenuar la patogenia. “A futuro, nuestro objetivo es poder hacer una vacuna para colaborar con las campañas de erradicación de la tuberculosis y paratuberculosis bovina”, destacó la investigadora del INTA.
Más de cuatro décadas después de su hallazgo, el descubrimiento de Milstein aún tiene por delante mucho potencial. De hecho, Alejandra Capozzo, especialista en Inmunología veterinaria aplicada e investigadora del Conicet en el Instituto de Virología e Innovaciones Tecnológicas (IVIT) del INTA, trabaja en el desarrollo de un test ELISA y otro de inmunofluorescencia para detectar la rabia en animales. “Nuestro trabajo se basa en la creación de una proteína –fragmento variable monocatenario (scFv)– para reconocer la glicoproteína del virus rábico”.
Entre las principales ventajas del desarrollo, Capozzo destacó que “se pueden producir en diferentes sistemas recombinantes, incluso en bacterias, por lo que son muy económicos, accesibles y poseen alto rendimiento y pureza”. Gracias a esta forma de producción, “nuestro objetivo es reemplazar a los monoclonales tradicionales para el diagnóstico de la rabia”, aseguró.
Los svFv pueden reemplazar por completo a los anticuerpos monoclonales tradicionales, se pueden conjugar a fluoróforos o enzimas y usarse, por ejemplo, en inmunofluorescencia y en citometría de flujo, entre otros.
Se trata de un avance tecnológico que mejorará la detección del antígeno rábico en animales. Este invento abarata los costos de producción y los hace más competitivos, en comparación con los test ELISA tradicionales y, además, es una plataforma innovadora.
El invento corresponde a una plataforma para capturar proteínas recombinantes en ELISA. Este desarrollo abre una nueva perspectiva para los ELISA basados en proteínas recombinantes, ya sea que se emplea para un anticuerpo o un antígeno.
“El ELISA para la detección del antígeno rábico que estamos desarrollando utiliza un fragmento variable monocatenario (scFv) derivado de un anticuerpo monoclonal que es producido en bacterias”, señaló Capozzo y agregó: “La proteína scFv conserva la especificidad de la inmunoglobulina original, por lo que es usada como captura y revelador, conjugado a peroxidasa, en un sistema llamado comúnmente, ELISA en sándwich”.
“Este desarrollo abre una nueva perspectiva para los ELISA basados en proteínas recombinantes. Con este invento se facilitará su producción, a costos competitivos”, puntualizó Capozzo.
En la actualidad, la Argentina es un país libre de fiebre aftosa reconocido por la Organización Mundial de Sanidad Animal (OIE, según la sigla en inglés). Sin embargo, las investigaciones vinculadas al desarrollo de vacunas y de test diagnósticos para la detección de diversas cepas o la diferenciación de animales infectados de vacunados, continúa.
En este sentido, un equipo de investigadores de los Institutos de Virología y de Biotecnología del INTA desarrollaron un anticuerpo monoclonal contra una proteína no estructural del virus de la aftosa. Entre otros usos, este monoclonal es un elemento clave dentro de un test diagnóstico capaz de diferenciar animales vacunados de animales infectados.
“Esta estrategia se basa en el hecho de que solo los animales que están infectados desarrollan anticuerpos contra las proteínas no estructurales del virus, las cuales se producen exclusivamente cuando el virus está replicando y es infectivo”, expresó Mariano Pérez Filgueira, especialista del Instituto de Virología e Innovaciones Tecnológicas del CICVyA del INTA, y agregó: “Mientras que los animales que están vacunados no tienen anticuerpos contra esas proteínas, ya que las vacunas tienen el virus inactivado y por lo tanto no se replica en el animal”.
“El virus de la aftosa es muy variable, por lo que es importante saber qué cepa está circulando y cuáles se utilizan para diseñar una vacuna”, explicó Pérez Filgueira quien coordina el proyecto de Inmunidad y Patogenia en Salud Animal del INTA, integra el Consejo Directivo de la Sociedad Argentina de Virología (SAV) y es el Presidente del xiii Congreso Argentino de Virología 2021.
Asimismo, los anticuerpos monoclonales pueden también servir para diferenciar las diversas cepas del virus que existen e identificar, por ejemplo, las que circulan en el campo. “Gracias a los avances tecnológicos y a la colaboración del doctor José La Torre y su equipo, en el Centro de Virología Animal (CEVAN) del Conicet se pudo construir una colección de más de 80 anticuerpos monoclonales diferentes que sirven para identificar distintas cepas virales”, puntualizó Pérez Filgueira y añadió: “Entre otras cosas, estos anticuerpos permiten controlar las cepas del virus con las cuales se formulan las vacunas comerciales, identificar aquellas que pudieran ser aisladas a campo y, además, son componentes críticos de los ensayos de ELISA que usa el Senasa para verificar, a nivel poblacional, la eficacia de las campañas de vacunación anti-aftosa en nuestro país”.
“Actualmente en investigación se dispone de una batería de anticuerpos monoclonales específicos contra determinados tipos celulares o moléculas del sistema inmune que nos permiten caracterizar con detalle los tipos de respuesta inmune que se generan”, indicó el coordinador del INTA quien detalló que se utilizan anticuerpos monoclonales cuando se busca identificar células del sistema inmune involucradas en determinadas respuestas o células que se generan frente a una inmunización, incluso se puede identificar en qué estadios del desarrollo o de activación están.
De hecho, el grupo de trabajo de Pérez Filgueira en el IVIT desarrolló una técnica basada en un anticuerpo monoclonal contra el IFN-γ bovino para medir la respuesta inmune contra el VFA en los animales vacunados y evaluar distintas formulaciones: “El ensayo se basa en el mismo principio que los que se usan para diagnosticar tuberculosis bovina, solo que en este caso la detección del interferón gamma en las muestras de sangre bovina incubadas in vitro con virus de la fiebre aftosa inactivado nos sirve para cuantificar la inmunidad celular desarrollada contra el virus en los animales, luego de la vacunación”.“Los anticuerpos monoclonales son considerados uno de los descubrimientos que cambiaron el destino de la inmunología y de las aplicaciones clínicas y terapéuticas”, enfatizó Pérez Filgueira y ponderó: “No se me ocurren muchos otros desarrollos que hayan tenido semejante impacto. Los anticuerpos monoclonales se utilizan en animales, en plantas y en humanos; el abanico es inmenso”.
En la Argentina, el Mal de Río Cuarto (MRC) es la enfermedad viral más importante del maíz (Zea mays L.) porque ocasiona importantes pérdidas económicas, ya sea por la disminución de la producción de granos o por la reducción de la biomasa para ensilaje o diferidos.
Mariana del Vas, bióloga, especialista en virología y biotecnología vegetal del Instituto de Agrobiotecnología y Biología Molecular del INTA, busca entender las bases moleculares, bioquímicas y celulares de la replicación viral para luego diseñar estrategias biotecnológicas de manejo de la enfermedad. Para eso, su equipo de trabajo obtuvo y seleccionó un tipo particular de anticuerpos monoclonales, denominados nanoanticuerpos, que presentan una altísima afinidad por proteínas no estructurales del virus que son necesarias para la replicación viral.
Los nanoanticuerpos, también llamados VHH o ‘nanobodies’ (en inglés) son los dominios variables derivados de un tipo de anticuerpo que carece de cadena liviana presente en camélidos (camellos, llamas, alpacas, guanacos y vicuñas), y son 10 veces más pequeños que los anticuerpos convencionales de mamíferos.
“En colaboración con Viviana Parreño –coordinadora científica de la plataforma Incuinta– y Serge Muyldermans –de la Universidad Libre de Bruselas– hemos obtenido y seleccionado nanoanticuerpos dirigidos contra el virus del Mal de Río Cuarto (MRCV) y los utilizamos para desarrollar un kit de ELISA para diagnosticar la presencia del virus, tanto en plantas de maíz como en el insecto que lo transmite”, señaló Del Vas y explicó: “Además, en un futuro esperamos expresar estos nanoanticuerpos en plantas transgénicas para interferir con la replicación viral y lograr resistencia. Las propiedades de los nanoanticuerpos (pequeño tamaño, alta afinidad y estabilidad) los hacen instrumentos ideales para este propósito”.
De acuerdo con un informe del Senasa, en el área endémica (departamento Río Cuarto, provincia de Córdoba), la enfermedad se presenta en forma recurrente todos los años con distintos grados de severidad, según sea la densidad poblacional de su insecto-vector (Delphacodes kuscheli) conocido vulgarmente como ‘chicharrita’.
